Non-invasive real-time analysis of single-cell electroporation phenomenon with microwave dielectric spectroscopy
Analyse non-invasive en temps réel du phénomène d’électroporation de cellules individuelles par spectroscopie diélectrique hyperfréquence
Résumé
The necessity to deliver therapeutic molecules in a targeted and efficient manner for the treatment of cancer and genetic diseases has led to the development of vectorization methodologies. Among them, ElectroPoration (EP) is a method that transiently permeabilizes cell plasma membranes through the controlled application of pulsed electric fields. EP thus allows the precise and efficient entry of poorly permeant or not permeant molecules into cells and tissues. In clinical practice, EP is used to enhance the cytotoxicity of anticancer agents administered at the tumor site, a methodology developed under the name ElectroChimioTherapy (ECT).
Although the efficacy of ECT has been demonstrated for treating solid tumors in humans, the reasons for differences in response to treatment between healthy and cancer cells, as well as the non-responsiveness in some cancer cells, still remain unknown. Being able to predict as early as possible the patients’ response to ECT treatment would increase the success rate and extend the use of ECT to various types of tumors. The scale of the individual cell offers the possibility to study the variability within the same cell population and to optimize the electrical parameters to be applied for personalized medicine. In this context, it is essential to improve our understanding of EP mechanisms and their short- and long-term dynamics. This requires the development of new analytical tools capable of monitoring intracellular dynamic mechanisms. Microwave Dielectric Spectroscopy (MDS) is particularly suited for characterizing cells directly in their culture medium, non-destructively and non-invasively. Previous thesis studies have demonstrated that MDS is adapted for real-time monitoring of induced cellular mechanisms, and for discriminating cell states following EP and ECT treatments performed ex situ.
Building on this work, this thesis aimed to evaluate the real-time early detection capabilities of MDS for cells subjected to in situ EP treatment. This involves simultaneously applying EP electrical conditions to an individual cell while analyzing its cellular modifications in real-time using MDS and fluorescence microscopy within the same microdevice.
First, we studied the EP phenomenon at a multicellular scale, on human cancer cell lines (THP-1 and HCT-116). We established treatment conditions (EP and ECT) that induce reversible or irreversible permeabilization. To do this, we studied the impact of EP and ECT treatments on cell viability using conventional methods and an innovative approach that evaluates the homeostasis in live cells.
We then developed in situ EP of individual cells within a miniature sensor initially designed for MDS measurements. We determined optically the electric field intensity values to apply for reversible or irreversible cell permeabilization.
Finally, we extended this study to the MDS monitoring of in situ EP of individual cells. To do this, we developed a test bench dedicated to the co-integration of optical conventional analysis methods with MDS. We demonstrated that MDS response is a real-time function of the global intracellular modifications induced by EP treatments, offering the prospect of a better understanding of the phenomenon according to cell type, and in the long term, a rapid assessment of treatment efficacy for personalized medicine.
La nécessité de délivrer des molécules thérapeutiques de manière ciblée et efficace pour le traitement du cancer et des maladies génétiques a motivé le développement de méthodologies de vectorisation. Parmi elles, l’ElectroPoration (EP) est une méthode permettant de perméabiliser transitoirement les membranes plasmiques des cellules grâce à l’application contrôlée de champs électriques pulsés. L’EP permet ainsi d’introduire de façon précise et efficace des molécules peu ou pas perméantes dans les cellules et tissus. En pratique clinique, l'EP est utilisée pour potentialiser la cytotoxicité d'agents anticancéreux administrés au niveau de la tumeur, méthodologie développée sous le nom d'ElectroChimioThérapie (ECT).
Bien que l’efficacité de l’ECT ait été démontrée pour le traitement de tumeurs solides chez l’humain, les raisons des différences de réponse aux traitements entre les cellules saines et les cellules cancéreuses, et de non-réponse de certaines cellules cancéreuses, sont à ce jour encore inconnues. Pouvoir prédire le plus précocement possible la réponse des patients à un traitement d’ECT permettrait d’augmenter le taux de réussite et d’étendre l’utilisation de l’ECT à divers types de tumeurs. L’échelle de la cellule individuelle offre la possibilité d’étudier la variabilité au sein d’une même population cellulaire, et d’optimiser les paramètres électriques à appliquer en vue d’une médecine personnalisée. Dans ce contexte, il apparait indispensable d’améliorer nos connaissances des mécanismes d’EP et de leur dynamique à court et long termes. Ceci impose de développer de nouveaux outils d’analyse, rendant compte des mécanismes dynamiques intracellulaires. La Spectroscopie Diélectrique HyperFréquence (SDHF) constitue une méthode particulièrement adaptée pour caractériser les cellules directement dans leur milieu de culture, de manière non destructive et non invasive. Il a été démontré lors de précédents travaux de thèse qu’elle permettait de suivre en temps réel des mécanismes cellulaires induits et de discriminer l’état cellulaire suite à des traitements d’EP et ECT réalisés ex situ.
Dans la continuité de ces travaux, cette thèse a eu pour objectif d’évaluer les capacités de détection précoce en temps réel par SDHF de cellules soumises à un traitement d’EP in situ. Cela implique de pouvoir simultanément appliquer des conditions électriques d’EP sur une cellule individuelle tout en analysant en temps réel ses modifications cellulaires par SDHF et par microscopie à fluorescence au sein d’un même microdispositif.
Dans un premier temps, nous avons étudié le phénomène d’EP à l’échelle multicellulaire, sur des lignées cancéreuses humaines (THP-1 et HCT-116). Cette étude a permis d’établir les conditions de traitements (EP et ECT) induisant une perméabilisation réversible ou irréversible. Pour ce faire, nous avons étudié l’impact de traitements d’EP et ECT sur la viabilité cellulaire en utilisant des méthodes conventionnelles et une approche innovante permettant d'évaluer l'homéostasie de cellules vivantes.
Nous avons ensuite développé l’EP in situ de cellules individuelles au sein d’un capteur miniature initialement conçu pour réaliser des mesures par SDHF. Cette étude a permis de déterminer par voie optique les valeurs d’intensités de champ électrique à appliquer pour perméabiliser les cellules de manière réversible ou irréversible.
Enfin, nous avons étendu cette étude au suivi par SDHF de l’EP in situ de cellules individuelles. Pour ce faire, nous avons développé un banc de test dédié à la co-intégration des méthodes d’analyse conventionnelle optiques avec la SDHF. Nous avons démontré que la réponse par SDHF est fonction en temps réel des modifications intracellulaires globales induites par les traitements d’EP, offrant des perspectives d’une meilleure compréhension du phénomène suivant le type cellulaire, et à plus long terme une évaluation rapide de l’efficacité de traitement pour une médecine personnalisée.
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